帶你認識流式細胞術PART 4
更新時間：2025-12-17
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流式分析的應用-細胞群比例測定
測定某細胞群體或者亞群的比例是流式細胞術最基本的應用，完成細胞群比例測定需要解決以下兩個問題。
問題1：
明確總體是什么，若要測定CD4 T細胞的比例，就首先要明確這個比例是相對于哪一個總體而言的，是占所有T細胞的比例還是占所有淋巴細胞的比例，總體是根據(jù)實驗具體要求決定的；
問題2：
明確這個細胞群體的特征表型（相對于總體細胞有什么特點），一般來說就是明確這個細胞群體相對于總體內(nèi)的其他細胞具有或者缺少哪個特征性的抗原，利用該抗原的相應熒光素偶聯(lián)抗體，就可以進行比例測定。
操作
明確總體和細胞群體的特征表型，先將總體設門（將總體所有細胞顯示于一張流式圖中），根據(jù)細胞群的特殊表型圈出該細胞群，就可以得出比例。
| 細胞群體 | 特征表型 |
| 造血干細胞 | Lin-CD34+CD38-（人）、CD117+（小鼠） |
| 免疫細胞 | CD45+ |
| T細胞 | CD3+ |
| CD4 T細胞 | CD3+CD4+ |
| CD8 T細胞 | CD3+CD8+ |
| 初始T細胞 | CD44 low CD62L high |
| 調節(jié)性T細胞 | CD4+CD25+Foxp3+ |
| B細胞 | CD19+或CD20+或CD45R+ |
| NK細胞 | NK1.1+（小鼠C57BL/6系）、DX5+（小鼠）、CD56+（人） |
| NKT細胞 | CD3+ TCRβ+ |
| 單核細胞 | CD14+ |
| 巨噬細胞 | CD11b+、F4/80+（小鼠） |
| 中性粒細胞 | Gr-1+CD11b+（小鼠）、CD11b+CD15+（人） |
| 樹突狀細胞 | CD11c high MHC二型+ |
流式分析的應用-表型測定
表型就是某種細胞表達一些重要抗原分子的情況，明確細胞表達這些抗原分子的情況就可以從一定程度上判斷這群細胞的某些特征，而且也可以從一定程度上判斷這群細胞的功能狀態(tài)。表型測定也需要解決以下兩個問題。
問題1：
明確測定哪個細胞群的表型，然后標記該特征表型的熒光素偶聯(lián)抗體（或標記其他細胞間接反映待測細胞，例3種細胞，待測細胞AB，其他細胞AC、BC等等）；
問題2：
明確需要測定哪個或者哪些表型，然后標記需要測定的這些表型的熒光素偶聯(lián)抗體（若表型較多，可以將樣品均分，標記不同抗體檢測）；
操作
先根據(jù)細胞群特征表型（一般是對應熒光素偶聯(lián)抗體所接收的通道）設門，將其顯示于一個流式圖中（流式圖中一個軸代表一個需要檢測的表型熒光信息），圈出表型陽性的細胞或者計算平均熒光強度（mean fluorecence intensity，MFI），就可以得出這群細胞表達該抗原分子的情況。
大多數(shù)的表型分子都位于細胞表面，所以標記時只需要將抗體加入到樣品細胞中即可。但有些位于細胞的內(nèi)部，應先將細胞固定，用打孔劑在細胞膜表面開孔后，再加入熒光素偶聯(lián)抗體，此時抗體就可以通過小孔進入細胞內(nèi)部與細胞內(nèi)的抗原結合。
流式分析的應用-細胞因子測定
細胞因子（cytokine）
是細胞合成和分泌的具有多種生物活性的低分子質量的多肽或蛋白質，一般在6-60kDa；
細胞因子的合成具有多源性，即不同細胞能夠合成、分泌同一種細胞因子；
細胞因子其作用具有多向性，即同種細胞因子可以作用于不同細胞，發(fā)揮不同的生理功能；
細胞因子一般以自分泌或者旁分泌的方式發(fā)揮作用；
根據(jù)功能可以分為6大類：白細胞介素（interleukin，IL）、干擾素（inferferon，IFN）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factoer，TNF）、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、趨化因子（chemokine）和生長因子（growth factoer、GF）。
檢測方法
主要有三種方法：ELISA、胞內(nèi)染色法、CBA（cytometric bead array）法。
流式分析的應用-細胞增殖檢測
流式細胞術檢測細胞增殖的方法有很多，根據(jù)待測細胞不同特征檢測方法也不同，廣泛使用的有相對計數(shù)法、示蹤染料標記法和BrdU標記法。
相對計數(shù)法-原理/操作
細胞增殖最直接的結果就是細胞數(shù)目的增加，如果控制樣品的體積一定，細胞數(shù)目的增加就是細胞濃度的增加，那么在相同的分析速度上樣時，濃度大的樣品單位時間內(nèi)被檢測到的細胞就越多（就是將對照組和各實驗組控制在相同的條件下直接上樣記錄流式細胞儀事件數(shù)，或記錄達到相同事件數(shù)的耗時，時間越短細胞濃度越大）。
相對計數(shù)法檢測細胞增殖不僅得到相對數(shù)值，也可以得到絕對值。如在對照組、實驗組中均加入1e5標記熒光的人工微球作為內(nèi)參，該微球大小與細胞相當。用相對計數(shù)法同時可以計數(shù)該PE標記的人工微球，以計數(shù)得到的數(shù)值為基值，其他對照組和實驗組的相對數(shù)值就可以根據(jù)此基值計算出各組的絕對數(shù)值。如低速上樣60s計數(shù)得到熒光標記微球數(shù)為2000，那么相對數(shù)值2000就代表絕對值1e5，若實驗組相對值測得5000，那么其絕對值就為2.5e5.
①對照組和實驗組每種細胞所加的濃度必須相同，每組至少設置三個復孔，取平均數(shù)；
②收集各組的細胞于Ep管中，注意必須將各組的所有細胞都收集起來，然后標記需要計數(shù)細胞的熒光素偶聯(lián)抗體，4℃下孵育30min；
③PBS重懸洗去游離的抗體，再用相同體積的PBS重懸沉淀，將細胞置于上樣管中計數(shù)（上樣前可加入7-AAD排除死細胞）；
④每個樣品低速上樣90s，計數(shù)目標細胞的數(shù)目（若加入內(nèi)參，同時計數(shù)人工微球數(shù)）。
示蹤染料標記法-原理/操作
示蹤染料能夠與細胞發(fā)生非特異性的不可逆性的結合，結合后相當穩(wěn)定，不會被酶類降解。
其結合主要有兩種機制：一種是能夠與細胞內(nèi)的蛋白質上的氨基發(fā)生非特異性的共價結合；另一種是能夠非特異性地嵌入細胞膜的磷脂雙分子層中與細胞膜發(fā)生非共價性結合。這些染料熒光信號非常強烈，當細胞分裂時，母細胞內(nèi)的染料會被平均分配到子細胞中，細胞的熒光信號就會減弱一半，所以通過檢測減弱的、發(fā)射示蹤染料熒光信號的細胞比例，就可以判斷細胞增殖的強弱。
| 染料 | 標記機制 | 激發(fā)波長/nm | 發(fā)射波長/nm | 備注 |
| CFSE | 蛋白質結合 | 488 | 525 | 常用 |
| PKH67 | 細胞膜嵌入 | 488 | 502 | 常用綠熒光膜結合染料 |
用CFSE標記測定細胞增殖時，首先在目標細胞增殖前用CFSE標記，再將標記的細胞置于增殖體系中，細胞進行增殖時，母細胞中的CFSE會被平均分配到子細胞中，第二代子細胞CFSE濃度為原始濃度的一般，第三代只有1/4，以此類推，而CFSE的濃度與其激發(fā)后發(fā)射的熒光強度呈正比，所以可以通過分析增殖后細胞的熒光強度來計算增殖活性，熒光強度減弱到標記時的1/2以及以下的細胞都是增殖后的細胞，這些比例越高，細胞增殖越活越。
①將目標細胞濃度調整為1e6/ml，加入CFSE，標記濃度5μmol/L。置于37℃下孵育15min，孵育過程中每隔3min左右混勻細胞一次；
②加入預冷的培養(yǎng)基終止標記，4℃下孵育5min，之后離心；
③再用培養(yǎng)基洗滌一次，然后將目標細胞置于增殖體系中；
④增殖結束后，上樣分析同一般樣品；
BrdU摻雜法-原理/操作
5-溴脫氧尿嘧啶核苷酸（bromodeoxyuridine,BrdU）是胸腺嘧啶核苷酸的類似物，特點是胸腺嘧啶環(huán)上5位C連接甲基被溴取代，在細胞增殖DNA合成時可以與內(nèi)源性的胸腺嘧啶核苷酸競爭摻雜到新合成的DNA中，而BrdU抗體可以特異性識別BrdU，不與胸腺嘧啶核苷酸結合，所以可以用于檢測細胞增殖。
但BrdU摻雜法也有缺點：抗BrdU抗體分子過大，雙鏈DNA中配對的堿基對會阻礙摻入的BrdU與熒光素的抗BrdU抗體的結合，因此為了暴露BrdU的表位，促進結合，目標細胞常需要經(jīng)過DNA酶或者濃鹽酸等強變性方法處理，這會給目標細胞帶來不小的損傷。所以BrdU摻雜法一般只適用于體內(nèi)檢測目標細胞的增殖，例如將BrdU摻入小鼠的飲用水中或者經(jīng)腹腔注射。
流式分析的應用-細胞凋亡檢測
目前細胞死亡的方式主要有兩種，細胞壞死（necrosis）和細胞凋亡（apoptosis）。免疫體系中主要區(qū)別：細胞壞死會釋放出內(nèi)容物，引起炎癥反應，而細胞凋亡不會暴露內(nèi)容物，一般被吞噬細胞清除。
流式細胞術是非常重要的檢測細胞凋亡的方法，既可以定性也可以定量，方法有很多種，以下主要介紹常用annexin V/PI雙染色法。
Annexin V/PI 雙染色法-原理/操作
正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的（細胞膜極性），活細胞中磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）位于細胞膜內(nèi)表面，細胞凋亡/壞死時，細胞膜發(fā)生變化，極化現(xiàn)象消失（PS均勻分布于細胞膜內(nèi)、外表面）。
Annexin V是一種對PS有高度親和力鈣依賴性的磷脂結合蛋白，可以特異性識別凋亡/壞死細胞表面的PS，而活細胞的PS位于細胞膜內(nèi)表面，無法與其結合，所以可以用偶聯(lián)FITC熒光的Annexin V鑒別死細胞和活細胞。
但是壞死細胞的PS也會從細胞膜內(nèi)表面翻轉到外表面，所以Annexin V無法區(qū)分壞死細胞和凋亡細胞，而PI染料能夠與細胞內(nèi)的DNA結合，能夠區(qū)分壞死細胞和活細胞，凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI染料無法進入細胞內(nèi)與DNA結合，所以PI無法標記凋亡細胞和活細胞，這樣就需要兩種染料聯(lián)合使用來區(qū)分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞。
操作方法與常規(guī)標記熒光抗體的方法一樣：加入適量的Annexin V-FITC和PI染料，4℃/常溫下孵育30min即可。
此外，用此方法檢測細胞凋亡，在流式圖設置象限，不能只根據(jù)對照所顯示的陰陽性界限，而應該根據(jù)細胞群的具體分布設置。因為在某些情況下，如檢測貼壁細胞的凋亡時，或操作過久等等外部條件導致一定程度的損傷細胞膜，從而使活細胞的膜內(nèi)PS少量翻轉到膜外，導致活細胞的FITC-Annexin V熒光信號整體向右移，應根據(jù)圖形向右適量移動十字象限。
流式分析的應用-細胞周期檢測
核酸熒光染料標記法-原理/操作
細胞周期就是細胞分裂產(chǎn)生新細胞開始到下一次分裂形成子細胞結束所經(jīng)歷的過程，主要分為G(0)期、G(1)期、S期、G(2)期、M期。細胞處于不同時期DNA含量不同，處于G(0)、G(1)期細胞含有二倍體量的DNA，處于S期DNA量在二倍體到四倍體之間，處于G(2)、M期細胞含有四倍體量的DNA。所以，可以利用非特異性核酸熒光染料與細胞內(nèi)的DNA結合，產(chǎn)生流式細胞儀可檢測到的熒光，通過區(qū)分熒光的強弱區(qū)分細胞處于哪一期。
| 染料名稱 | 類別 | 特點 |
| PI（propidium iodide） | 細胞膜非通透性 | 應用廣泛，使用前需增加細胞膜通透性并加入RNA酶降解RNA |
| 細胞膜通透性 | 標記效果好，但需紫激光激發(fā) | |
| Hoechst33258、33342 | 細胞膜通透性 | 活細胞標記，但需紫激光激發(fā) |
| AO（acridine orange） | 細胞膜非通透性 | 可具體區(qū)分細胞的5個周期 |
①配制低滲檸檬酸標記液：檸檬酸三鈉0.25g、Triton-X-100 0.75ml、PI 0.025g、RNA酶0.0005g、再用雙蒸水補至250ml；
②將目標細胞制成單細胞懸液，取2e6細胞離心，棄上清；
③加入1ml低滲檸檬酸標記液重懸，混勻，4℃下孵育30min；
④離心，棄上清，加入200μl PBS重懸混勻上樣分析；
去除黏連體
實際樣品中經(jīng)常會出現(xiàn)粘連的雙細胞或多細胞團塊，而流式分析時可能將粘連在一起的兩個二倍體細胞當作一個四倍體細胞，結果G(2)、M期比例會偏高，所以可以在樣品處理過程中加入少量EDTA，減少細胞之間的粘連；流式分析時，可以將目標細胞顯示在相應熒光通道的A（area）-W（Width）散點圖中區(qū)分。
流式分析的應用-基因表達檢測
在具有活性的單細胞水平上檢測基因表達對于研究細胞的功能非常重要，能夠應用于細胞工程系、細胞信號轉導和功能基因組學等。流式檢測活細胞內(nèi)的基因表達要求能夠正確指示目標基因轉錄的、敏銳的、沒有毒性的熒光指示系統(tǒng)，其中常用的兩個報告基因是編碼綠色熒光蛋白的基因和編碼β-半乳糖苷酶的基因lacZ或β-內(nèi)酰胺酶/CCF2指示系統(tǒng)。
綠色熒光蛋白指示基因系統(tǒng)-原理/操作
綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是從水母Aequorea Victoria中提取的一種有內(nèi)在熒光基團（internal fluorophore）的蛋白質，被488nm激光激發(fā)后能夠產(chǎn)生507nm的熒光，其信號被FITC/FL1通道接收，編碼該蛋白質的基因是常用的指示報告基因。
表達該蛋白非常簡單只需要將編碼GFP的基因整合到目標基因的啟動子后面（pMAX-GFP、pcDNA3.1-GFP/EGFP等），當目標基因表達時也會同時表達GFP基因，表達后的GFP蛋白質積存于細胞內(nèi)，細胞內(nèi)GFP的量與目標基因的表達強弱成正比，檢測到的熒光信號強弱間接反映目標基因的表達情況。
①構建質粒：在需要檢測的目的基因啟動子之后整合GFP/EGFP片段基因；
②利用各種轉染的方式將質粒導入細胞內(nèi)，按適宜的條件培養(yǎng)細胞；
③因細胞內(nèi)含熒光指示蛋白，所以一般不需要其他熒光素標記染色，直接收取細胞離心，棄上清并用PBS重懸上樣分析即可；
流式分析操作簡單，對細胞刺激較小，但是GFP熒光信號較弱，一個細胞內(nèi)至少需要表達 50 000-100 000個GFP分子，其產(chǎn)生的熒光信號才能被檢測到（現(xiàn)構建質粒一般會選擇強熒光信號的GFP蛋白異構體，S65T、V163A等）。因質粒轉染的效率不可能達到100%，流式檢測無法區(qū)分單個細胞是否轉染成功。解決方法：在質粒載體中再加入一個對照基因，如DsRed，表達DsRed蛋白的細胞就是轉染成功的細胞，然后分析表達GFP的細胞占所有表達DsRed細胞的比例即為目的基因表達的比例。
